人们观察到荧光现象已有数千年的历史，早在公元前 1500 年的中国书籍中就有记载。 几百年前，约翰-W-冯-歌德在他的《色彩理论》中描述了荧光现象。 他要求读者”……将一块新鲜的七叶树皮浸入一杯水中，树皮会立即变成天蓝色。 “然而，直到今天，我们才真正了解这一现象，并有能力控制和利用其过程。
应用与概况
荧光现象
荧光是发光的一种特殊形式，是冷体中的一种光学现象，在这种现象中，分子吸收高能光子，并以较低的能量或较长的波长重新发出这种光。 荧光一词是以矿物氟化钙命名的，因为人们看到氟化钙有这种现象。
吸收光子和发射光子之间的能量差以分子振动（热量）的形式释放出来。 通常情况下，吸收的光子在光谱的紫外部分，发出的光（发光）在可见光范围内，但这取决于特定荧光团的吸收曲线和斯托克斯位移。 斯托克斯偏移是以爱尔兰物理学家乔治-斯托克斯（George G. Stokes）的名字命名的，是指同一电子转变产生的吸收和发光的波段最大值（或波段原点）的光谱位置之间的差异（通常以频率单位表示）。
一般来说，波长长于吸收的发光比波长短于吸收的发光更强。 后者可称为反斯托克斯偏移。 每种荧光材料都有自己的独特值，基本上是一种指纹，可以清楚地识别材料。
由于当今的测量技术复杂、昂贵，而且只能在实验室中使用，因此荧光技术在许多应用中并不总是可行的。 实验室测量系统虽然灵敏度高，但通常体积庞大，价格昂贵。
荧光测量需要复杂、高灵敏度的系统，因为发射能量（即样品荧光的能量）比激发能量小近一百万倍。 发射波长与激发波长（20-30 nm）略有不同，这是这项技术面临的挑战之一。 此外，实验室测量系统使用激光或高压灯（用于可变波长）来激发样品，并使用光电倍增管或 ccd 检测器等高灵敏度检测器来测量发射的能量。 激发和发射的光学分离通常以 90° 的测量角进行。 这种测量原理被称为 “离轴测量”，需要对样品上的激发光束和发射光束进行非常精确的定位。 因此，实验室系统功能强大，能够检测任意荧光物体。 然而，这些系统体积大、重量重、能耗高，而且无法在恶劣的环境条件下使用，因为温差、湿度或灰尘颗粒会对测量结果产生巨大影响。 这些系统的操作通常需要训练有素的人员，从而产生额外费用。 因此，这些系统的使用仍局限于实验室和研究机构。
事实证明，荧光是一种应用广泛的工具。 这种强大的技术可用于研究分析化学、生物化学、细胞生物学、生理学、肾脏病学、心脏病学、光化学、环境科学以及其他领域的分子相互作用。 与其他基于光的调查方法相比，荧光检测有三大优势：高灵敏度、高速度和安全性。 这里的安全是指样品在加工过程中不会受到影响或破坏，也不会产生有害的副产品。
仪器、软件、探针和应用方面的新发展使这项 150 多年前就已出现的技术更加普及。 有许多天然和合成化合物都会发出荧光，它们在诊断、医疗或生化方面有许多不同的应用。
例如，可将荧光化学物质或荧光团附着在感兴趣的大型生物分子上，然后利用荧光来识别是否存在感兴趣的分子。 这样就能进行非常具体的分析，更重要的是，由于信号强度取决于样品中荧光团的数量，因此还能获得定量结果。 其应用包括 DNA 测序、生物芯片、肿瘤和免疫标记物检测。
荧光还可用于许多工业应用，例如识别物质、表面涂层和最终产品。其应用包括真伪鉴别（纸币、昂贵的消费品）、涂层检测以及燃料或油的标记。 此外，有机材料在紫外光的激发下通常会发出强烈的自发荧光，这种特性的应用非常广泛，无需使用额外的荧光标记。 其中一个例子是在卫生检测中测量污染（如水中的油）和检测表面的油脂残留物。
常见应用
免疫荧光（IF）：免疫荧光用于检测抗原或抗体的存在。 这种技术是将用荧光染料标记的特异性抗体应用于研究样本。 然后，研究人员可以利用荧光显微镜观察这些目标分子在细胞或组织中的定位和存在情况。
荧光原位杂交（FISH）：FISH 是一种使用荧光标记 DNA 探针检测细胞或组织中特定 DNA 序列的技术。 这种方法通常用于识别染色体异常、基因突变或研究微生物感染。
荧光免疫分析法（FIA）：荧光标记的抗体或抗原用于免疫测定，以确定样品中特定分析物的含量。 这种方法可以对蛋白质、激素或感染标记物等生物大分子进行灵敏的定量分析。
荧光 PCR（聚合酶链反应）：荧光染料可用于 PCR，实时监测 DNA 扩增。 这种定量 PCR（qPCR）可快速准确地测定 DNA 目标序列的初始浓度，常用于诊断感染或遗传疾病。
荧光细胞分析（流式细胞仪）：这种方法可根据荧光标签对细胞进行分析和分类。 荧光染料可用于识别特定细胞群、检查表面分子的表达或分析细胞内成分。
在体外诊断中使用荧光技术具有灵敏度高、特异性强和复用能力强的优点，因为可以同时检测多种荧光染料。 这样就可以在诊断研究和临床应用中对生物样本进行复杂而多样的分析。
使用 PCR 系统进行说明
荧光染料用于聚合酶链式反应（PCR），以实时监测扩增反应的进展。 这样就可以对样品中目标 DNA 分子的初始浓度进行定量分析。 荧光在 PCR 中的优势在于能够实时而非仅在反应结束时跟踪每个扩增周期中产生的 DNA 量。
下面是一个在 PCR 中使用荧光的简单例子：
制备目标 DNA 分子：将待分析的 DNA 与特定引物（在待扩增区域外侧的 DNA 短片）和标记有荧光染料的探针寡核苷酸混合。
进行 PCR：启动 PCR，使用 DNA 聚合酶和引物对 DNA 进行短周期扩增。 在扩增过程中，荧光探针会与正在发育的 DNA 链结合。
荧光检测：在每个扩增周期中，荧光都由一个特殊的检测系统进行测量。 随着 DNA 数量的增加，荧光也会变得更加强烈。
实时监测：达到可测量的荧光阈值（Ct 值，阈值周期）所需的 PCR 周期数与样品中目标 DNA 分子的初始浓度相关。 Ct 值越低，表明初始浓度越高。
优势
定量分析：荧光实时 PCR 可精确定量目标 DNA 分子的初始浓度。
快速出结果：与传统 PCR 只有在反应完成后才进行分析不同，实时监测可快速生成数据。
多路复用：通过使用不同的荧光染料，可同时扩增和量化同一样本中的多个目标分子。
早期检测：在诊断应用中，该方法可用于感染、基因突变或其他目标分子的早期检测。
因此，荧光实时 PCR 是分子诊断中的一项强大技术，可用于感染诊断、基因表达分析和基因变异检测等众多领域。
